CST抗體選擇指南

很多剛剛開(kāi)始信號通路研究的朋友，在訪(fǎng)問(wèn)CST網(wǎng)站查找抗體的時(shí)候，常常被多個(gè)抗體貨號和不同的抗體信息所困擾，不知道該如何選擇合適的抗體。為此，CST的技術(shù)支持團隊希望通過(guò)這篇文章，系統介紹抗體的相關(guān)背景知識，為大家正確選擇適合自身研究需要的CST抗體提供幫助。

一、CST抗體的制備工藝

根據抗體制備的原理和方法，主要分為單克隆抗體、多克隆抗體和基因工程抗體三大類(lèi)。

早期傳統的抗體制備方法是將抗原經(jīng)各種途徑免疫動(dòng)物，由于抗原物質(zhì)具有多種抗原決定簇，故可刺激產(chǎn)生多種抗各種決定簇的抗體,形成細胞克隆，合成和分泌抗體到血清或體液中，故在其血清中實(shí)際上是含多種抗體的混合物，這種用體內免疫法所獲得的免疫血清為多克隆抗體（polclonal antibody, Pab），也是di一代抗體。由于這種抗體是不均一的，無(wú)論是對抗體分子結構與功能的研究或是臨床應用都受到很大限制，因此如何能獲得均一性抗體成為關(guān)注的問(wèn)題。

如能將所需要的產(chǎn)生抗體的細胞株系選出并能在體外進(jìn)行培養即可獲得特異的單克隆抗體（monoclonal antibody, Mab），它是由識別一種抗原決定簇y的細胞克隆所產(chǎn)生的均一性抗體，目前很多單克隆抗體大都利用雜交瘤細胞技術(shù)產(chǎn)生，這種用雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體可視為第二代抗體。單克隆抗體由于純度高、特異性強、可以提高在各種抗體應用中檢測抗原的敏感性及特異性，已經(jīng)被廣泛采用。

CST的單克隆抗體主要為兔源和鼠源兩大類(lèi)。由于CST在單克隆抗體的細胞克隆篩選和多種應用的驗證等方面非常嚴格，保證了CST單克隆抗體保持著(zhù)業(yè)界的水平。目前，CSTgao品質(zhì)的抗體被稱(chēng)為XP^®（eXceptional Performance）的單克隆抗體，這些抗體無(wú)論在效價(jià)、應用類(lèi)型和種屬、特異性等方面的表現都更加，也是我們重點(diǎn)推薦的新一代產(chǎn)品。

由于需要研制人源單克隆抗體用于臨床治療，基因工程抗體(genetically engineering antibody)技術(shù)在80年代早期興起。這一技術(shù)是將對Ig基因結構與功能的了解與DNA重組技術(shù)相結合，根據研究者的意圖在基因水平對Ig分子進(jìn)行切割、拼接或修飾，甚是人工合成后導入受體細胞表達，產(chǎn)生新型抗體，也稱(chēng)為第三代抗體。

基因工程抗體包括嵌合抗體、重構抗體、單鏈抗體、單區抗體及抗體庫等。CST近年來(lái)一直致力于新型基因工程抗體的研究并嘗試用于治療性抗體開(kāi)發(fā)，并于2012年*在《Nature Biotechnology》雜志公布的研究進(jìn)展——A proteomics approach for the identification and cloning of monoclonal antibodies from serum，CST將這種技術(shù)稱(chēng)為NG-XMT™技術(shù)，這是一種結合了下一代測序技術(shù)（NG-sequencing）和蛋白組學(xué)技術(shù)從抗血清中進(jìn)行克隆篩選和鑒定的基因工程抗體制備工藝，能夠大大提高治療性單克隆抗體制備的效率。

二、CST一抗（primary antibody）的選擇

正確選擇CST一抗一般需要如下幾個(gè)方面的信息：

1）蛋白的名稱(chēng)及亞型：某些蛋白具有多種不同的亞型，如IKK、PKC、p38等，這需要在選擇抗體之前確定要研究的蛋白亞型。還有些抗體由于其抗原選擇的是不同蛋白亞型共有的肽段區域，是可以同時(shí)識別多個(gè)亞型的，我們一般都會(huì )在抗體的名稱(chēng)中加入（pan）字樣來(lái)標明，如Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb #4691，就可以識別Akt1、2、3等多個(gè)亞型，結果反映的也是所有Akt亞型的總水平。

2）磷酸化修飾位點(diǎn)：由于CST抗體有很多是針對蛋白的磷酸化修飾位點(diǎn)，因此CST抗體的命名往往會(huì )在蛋白名稱(chēng)后加上括號來(lái)標注，如Phospho-4E-BP1 (Ser65) Antibody #9451，Ser65即此抗體識別的修飾位點(diǎn)，在選擇合適的CST抗體用于特定修飾位點(diǎn)研究時(shí)，需要特別注意。有關(guān)不同修飾位點(diǎn)的功能，可以通過(guò)查閱文獻確定，或登陸phosphosite.org（目前zui全的蛋白修飾位點(diǎn)數據庫）查詢(xún)，也可以通過(guò)點(diǎn)擊CST網(wǎng)站該產(chǎn)品頁(yè)面中的Background（背景知識）來(lái)獲取。另外，由于有的蛋白存在不同亞型且序列高度同源，而不同亞型的某些磷酸化修飾位點(diǎn)周?chē)男蛄?相同，因此CST的某些抗體往往會(huì )同時(shí)識別不同亞型的相似修飾位點(diǎn)，如Phospho-IKKα/β (Ser176/180) (16A6) Rabbit mAb #2697既可識別Ser176位點(diǎn)磷酸化的IKKα，也可以識別Ser180位點(diǎn)磷酸化的IKKβ，結果反映的也是兩者共有的水平。

3）抗體已驗證的應用（如WB，IHC，IP等）：CST抗體一般會(huì )在出廠(chǎng)前對常見(jiàn)的抗體應用（WB，IHC，IP, ChIP，IF，Flow）進(jìn)行內部驗證，以確定可以滿(mǎn)足的不同應用要求。通過(guò)驗證，達到質(zhì)檢要求的抗體會(huì )明確標記，以備參考。一些沒(méi)有標明的應用，往往是因為經(jīng)過(guò)驗證沒(méi)有達到質(zhì)檢標準而不推薦。比如Acetyl-Histone H3 (Lys18) (D8Z5H) Rabbit mAb #13998可以滿(mǎn)足除IF以外的所有其他5種應用，有的客戶(hù)會(huì )認為，既然該抗體可以用于IHC，根據經(jīng)驗推斷應該可以用于IF，那么很有可能會(huì )浪費很多時(shí)間和試劑而不能獲得結果。也有一些沒(méi)有標明的應用，可能是因為我們沒(méi)有用于檢測的樣本而沒(méi)有檢測CST不推薦您使用沒(méi)有標明的應用?？梢蕴暨x其他的貨號，我們可能有適用于這個(gè)應用的更好的其它產(chǎn)品。

另外，一般直接帶有偶聯(lián)物的一抗，只能用于特定的應用，也會(huì )明確標記。

4）抗體能夠識別的樣本種屬：CST抗體一般會(huì )在出廠(chǎng)前對常見(jiàn)的不同種屬目標樣本進(jìn)行內部驗證，以確定可以滿(mǎn)足的不同種屬類(lèi)型，可以在產(chǎn)品頁(yè)面的Species-Reactivity一欄中看到（如人、小鼠、大鼠等）。通過(guò)驗證，達到質(zhì)檢要求的種屬會(huì )明確標記，以備參考。對于有些抗體，在 Species-Reactivity 的種屬里，有些種屬會(huì )加上括號，這表示根據序列同源比對，是100%符合的，但是我們并沒(méi)有做過(guò)關(guān)于這些種屬的實(shí)驗，所以不建議使用。

一些沒(méi)有標明的種屬，也有可能是可以應用的，建議通過(guò)聯(lián)系CST技術(shù)支持來(lái)獲得相關(guān)抗原序列比對的信息，以確定是否可以用于該種屬的樣本。

5）CST制備抗體的抗原：抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來(lái)，其中的免疫原包括：全長(cháng)蛋白、蛋白片段、多肽、全有機體（如：細菌）或細胞，CST抗體說(shuō)明書(shū)一般都有免疫原的描述，如果打算檢測的是蛋白片段或一種特殊的同型物或蛋白全長(cháng)的某一區域，則必須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。如果打算用FACS流式檢測活細胞的表面蛋白，則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來(lái)免疫制備的抗體。不同類(lèi)型的抗原對所得到的抗體會(huì )對其應用產(chǎn)生一定影響。CST科學(xué)家一般都會(huì )對抗體制備所用的抗原進(jìn)行說(shuō)明，并對抗體的各種常規應用在出廠(chǎng)前進(jìn)行驗證，以確定該抗體能夠滿(mǎn)足的應用。

6）抗體的動(dòng)物來(lái)源：CST一抗（primary antibody）的動(dòng)物來(lái)源多為兔（rabbit）和小鼠（mouse），動(dòng)物來(lái)源和單/多抗信息可通過(guò)產(chǎn)品名稱(chēng)和產(chǎn)品頁(yè)面或說(shuō)明書(shū)的Source / Purification得到。由于很多抗體的應用（如IHC，IF等）需要通過(guò)第二抗體（二抗）的進(jìn)一步結合和信號放大，而第yi抗體是通過(guò)特定抗原免疫動(dòng)物而獲得，產(chǎn)生抗體的動(dòng)物來(lái)源也決定著(zhù)第二抗體的選擇。一般說(shuō)來(lái)，在使用無(wú)偶聯(lián)物的一抗時(shí)，一抗宿主動(dòng)物的物種選擇較為重要，對于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應，例如：檢測小鼠樣本蛋白，則不應選擇小鼠或大鼠源的一抗，選兔源的一抗。

7）抗體的克隆號（如D6B6）：CST的某些抗體會(huì )含有克隆篩選過(guò)程中確定的原始克隆位置編號信息，如Phospho-EGF Receptor (Tyr1173) (53A5) Rabbit mAb #4407中的53A5就是原始的克隆號。這些信息一般對于抗體選擇沒(méi)有太大的影響，只是當同樣的修飾位點(diǎn)有不同的克隆來(lái)源時(shí)，用克隆號標注以示來(lái)源不同。

8）抗體的規格：CST抗體一般有3種規格，分別是40 µl ( 4 western blots )、100 µl ( 10 western blots ) 和300 µl ( 30 western blots )。zui為常見(jiàn)的是100 µl ( 10 western blots )。10 western blots 代表該抗體可以做 10 次標準 western blots 膜的孵育，即大約可做100個(gè)樣本。具體計算如下：該抗體用于 WB 的稀釋比例為 1:1000，我們假定一張膜多用 10 ml 一抗工作液孵育，那么，需用 10ml 的 TBST, 按照說(shuō)明書(shū)上建議的 5%BSA 或者 5% non-fat milk, 加入 10ul 的抗體配置成一抗工作液。因此，100ul 一抗原液可用于 10 次 western blots。

以查找ISG15抗體為例，先登陸CST公司網(wǎng)站，然后在 Search方框里輸入ISG15，會(huì )出來(lái)#2578和#2743這兩個(gè)抗體，讓我們看一下它們的區別：#2758 是個(gè)兔單抗，括號里的 22D2 代表克隆號，可以做的實(shí)驗是 Western(免疫印跡)、IP(免疫沉淀)，可應用的種屬是 H(人)和 Hr(馬)；#2743 是個(gè)兔多抗(可查看產(chǎn)品信息頁(yè)面“Source / Purification”部分)，可以做的實(shí)驗是 Western、F( 流式細胞術(shù) )、E-P( 以肽為包被抗原的 ELISA)，應用的種屬是 H、M(小鼠)、Mk(猴子)。如果說(shuō)你要做 Western，所用的樣本來(lái)自人，那么這兩個(gè)抗體都是可以的。

三、CST二抗（secondary antibody）的選擇

二抗的選擇先要考慮一抗的物種來(lái)源，例如：如果選擇的一抗是小鼠的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗anti-mouse secondary。其次，二抗的選擇要考慮具體的應用類(lèi)型，CST提供的二抗根據不同的應用分為兩大類(lèi)：酶聯(lián)（HRP或AP偶聯(lián)）二抗（免疫印跡和免疫組化應用）和熒光二抗（免疫熒光和流式應用）。

二抗連接的標記酶多為辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP），標記酶通過(guò)生化反應與其底物產(chǎn)生有顏色的沉淀物，從而顯示目的蛋白的位置和含量，一般常見(jiàn)各種底物信息如下：

而熒光標記物用特殊波長(cháng)的光激發(fā)時(shí)發(fā)射出可見(jiàn)光，CST采用的熒光標記物多為Alexa Fluor^®系列染料，分別為Alexa Fluor^®488、555，594和647。另外，CST還具有非可見(jiàn)光區的染料偶聯(lián)抗體，主要使用的Dylight系列染料，分別為DyLight™680和DyLight™800 Conjugate。這些熒光染料的激發(fā)光和發(fā)射光波長(cháng)信息如下。

CST還有一些特殊的二抗用于特定的應用，如構象特異性或單鏈特異性二抗，是為了防止在免疫沉淀（IP）這一應用中二抗與微珠結合的抗體在后續的WB檢測中發(fā)生交叉反應而特別設計的。