疏水作用層析法（蛋白質(zhì)純化實(shí)驗）原理及步驟

原理

在疏水層析的主要支持介質(zhì)上含有大小不等的疏水側鏈，烷基或芳香基，可是絕大多數情況起作用的是苯基或辛基。當碳氫鏈長(cháng)度增加，即變得更疏水時(shí)，疏水強的少量蛋白質(zhì)被吸附。這時(shí)疏水相互作用太強，需用特殊方法洗脫，可能會(huì )導致蛋白質(zhì)變性。苯基瓊脂糖比辛基瓊脂糖疏水性低，是疏水純化中效果不錯的常用介質(zhì)，尤其是試用于純化開(kāi)始時(shí)。

疏水相互作用介質(zhì)

苯基瓊脂糖-O-CH2-CHOH-CH2-O-C6H5

辛基瓊脂糖-O-CH2-CHOH-CH2-O-（CH2）7-CH3

溶液鹽濃度增加時(shí)疏水作用變得更強。因此，大多數疏水層析程序都是高鹽時(shí)上樣，降低鹽濃度時(shí)洗脫。所以在硫酸銨沉淀或離子交換層析后可以方便地直接進(jìn)行疏水層析純化。溫和的洗脫條件及高蛋白質(zhì)結合容置（10～100 mg/ml）使疏水層析在蛋白質(zhì)純化中成為很有價(jià)值的方法，也是更換緩沖液的方法之一。

材料與儀器

蛋白質(zhì)樣品液
苯基瓊脂糖 CL-4B NaCl 硫酸銨 磷酸鈉鹽
層析柱

步驟

下述方案設定樣品是在 75％ 硫酸銨沉淀后溶在 50％ 硫酸銨溶液的情況。

1. 裝填 5 ml 苯基瓊脂糖 CL-4B 進(jìn)入柱內；

2. 10 倍柱床體積層析緩沖液（20 mmol/L，pH 7.0 磷酸鈉鹽，50％ 硫酸銨）洗柱；

3. 調整樣品液符合要求，即在 pH 7.0 磷酸鈉緩沖液中含 50％ 硫酸銨。上樣總蛋白量 200～500 mg；

4. 3 倍柱床體積層析緩沖液洗柱或洗至 A280 值回到基線(xiàn)；

5. 用分步梯度法洗脫。每步依次分別采用兩倍體積各含 40％、30％、20％、10％ 或 0％ 硫酸銨的 pH 7.0 磷酸鈉緩沖液洗脫；

6. 再依次用 5 倍體積水、5 倍體積 1 mol/L NaCl 和 5 倍體積水洗柱，使其獲得再生。

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