包含體蛋白質(zhì)提取和純化的原理和操作步驟

簡(jiǎn)介

在利用大腸埃希菌表達重組蛋白時(shí)，經(jīng)常會(huì )得到包含體。包含體分離純化難度大，只有在變性后才能形成可溶性的形式予以純化。純化后的變性蛋白質(zhì)需要重新復性（renaturation），才能折疊成正確的天然構象和恢復原有的生物活性。

原理

包含體是細胞感染病毒后胞漿或核中出現的特殊結構。 常用于病毒病的診斷。 根據病毒種類(lèi)，包含體表現大小不一，形態(tài)各異，單一或多個(gè)，嗜酸或嗜堿。 它代表著(zhù)病毒粒子的合成場(chǎng)所，故又稱(chēng)病毒工廠(chǎng)（virus factory）或病毒原質(zhì)體（viroplasma）。包含體分離純化難度大，只有在變性后才能形成可溶性的形式予以純化。純化后的變性蛋白質(zhì)需要重新復性（renaturation），才能折疊成正確的天然構象和恢復原有的生物活性。

材料與儀器

試劑：

溶菌酶、EDTA、Tris、去垢劑 Triton X-100、尿素

儀器：

超聲破碎儀、離心機、凝膠層析柱、透析袋

步驟

（一）裂菌、洗滌及溶解

1．裂菌利用溶菌酶破碎細菌的細胞膜，再結合超聲破碎方法裂解細菌。細菌裂解后，5000～20000 g 離心 15 分鐘，可以使大多數包含體沉淀，與可溶性蛋白分離開(kāi)。

2．洗滌為了棄除包含體上黏附的雜質(zhì)，通常用低濃度的變性劑，如含 2mol/L 尿素的 1 mmol/LEDTA（50 mmol/L Tris，pH7.0～8.5）洗滌。過(guò)高濃度的尿素或鹽酸胍會(huì )使包含體溶解。溫和的去垢劑 Triton X-100 和脫氧膽酸也可以棄除膜碎片和膜蛋白。

3．溶解利用 6～8 mol/L 尿素或 5～8 mol/L 鹽酸胍將包含體溶解。鹽酸胍是強于尿素的變性劑。

（二）變性蛋白質(zhì)的復性

1．復性過(guò)程蛋白質(zhì)在尿素濃度為 4 mol/L 時(shí)開(kāi)始復性，到 2 mol/L 時(shí)復性結束。對于鹽酸胍而言，從濃度為 4 mol/L 開(kāi)始復性，到 1.5 mol/L 時(shí)復性結束。常用的包含體蛋白質(zhì)復性方法有疏水層析柱復性和凝膠層析柱復性?xún)深?lèi)。凝膠層析柱復性均用 Sephacryl S-100 或 Superdex 75 等層析介質(zhì)，層析柱的長(cháng)度為 40～100 cm。層析柱復性回收率高（高達 90% 以上）、速度快、易于放大、樣品稀釋倍數?。ㄒ话?5 倍左右）。

2．復性效率蛋白質(zhì)復性取決于蛋白質(zhì)本身的特性以及所處的環(huán)境。有些蛋白非常容易復性，如牛胰 RNA 酶的復性效率可以達到 95% 以上，但有一些蛋白至今還沒(méi)有發(fā)現能夠使其復性到天然構象的理想方法。純化白細胞介素-2 時(shí)，以 SDS 溶液中加入銅離子（0.05% SDS，7.5～30 μmol/L CuCl2）的方法，25～37 ℃ 下反應 3 小時(shí)，再用 1 mmol/L EDTA 終止反應，復性后的二聚體低于 1%。一般說(shuō)來(lái)，蛋白質(zhì)的復性效率應在 20% 左右。

3．影響復性效率的因素復性緩沖液的最適 pH 是 8.0～9.0，最適溫度為 4 ℃，復性時(shí)間一般為 24～36 小時(shí)。復性時(shí)的蛋白質(zhì)濃度應該控制在 0.1～0.5 mg/ml，過(guò)高的濃度會(huì )影響到復性。在磁力攪拌下，逐滴將變性的蛋白質(zhì)加入復性液中，使變性的蛋白質(zhì)在復性緩沖液中始終處于低濃度狀態(tài)。如果過(guò)快地將變性蛋白質(zhì)加入到復性緩沖液中，容易形成絮狀沉淀，這是蛋白質(zhì)重新凝聚的前兆。

復性完畢后，蛋白質(zhì)要裝入透析袋，在低濃度的緩沖液中連續緩慢透析 12～24 小時(shí)；透析不能太快；透析前后均要離心。

4．提高包含體蛋白復性產(chǎn)率的方法在包含體蛋白質(zhì)復性過(guò)程中，加人促進(jìn)劑可以增加折疊復性中間體的溶解性，導致形成穩定的、具有正確天然結構的蛋白質(zhì)。

（1）添加氧化交換系統：對于含有二硫鍵的蛋白，復性過(guò)程通過(guò)氧化交換系統可以促使不正確的二硫鍵配對發(fā)生快速交換反應，從而提高了正確配對的二硫鍵的產(chǎn)率。常用的氧化交換系統有谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）、DTT/GSSG 等，其中 GSH/GSSG 最為常用。通常使用 1～3 mmol/L 還原型巰基試劑，還原型和氧化型巰基試劑的比例通常為 10:1～5:1。

（2）添加小分子化合物：小分子化合物通過(guò)破壞錯誤折疊中間體的穩定性，或增加折疊中間體和未折疊分子的可溶性來(lái)提高復性產(chǎn)率，如鹽酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺類(lèi)等，在非變性濃度下是很有效的促進(jìn)劑。蛋白質(zhì)的輔助因子 Zn＋ 或 Cu＋ 可以穩定蛋白質(zhì)的折疊中間體，防止蛋白質(zhì)的聚集。濃度大于 0.4 mol/L 的 Tris 緩沖液可提高包含體蛋白質(zhì)的折疊效率，濃度為 0.4～0.6 mol/L 的 L-Arg 有助于增加復性中間產(chǎn)物的溶解度。硫代甜菜堿類(lèi)物質(zhì)（non-detergent sulfobetaines，NDSBs）是近年來(lái)出現的可促進(jìn)蛋白復性的新家族，NDSBs 由一個(gè)親水的硫代甜菜堿及一個(gè)短的疏水基團組成，不屬于去垢劑，易于透析去除。目前常用的有 NDSB-195，NDSB-201 和 NDSB-256。

（3）添加分子伴侶和折疊酶：研究得比較透徹的分子伴侶有 Hsp60/GroE 和 Hsp70/DnaK。折疊酶包括硫氧還蛋白二硫鍵異構酶、肽酰輔氨酰順?lè )串悩嬅傅?。但這類(lèi)蛋白在折疊復性后要除去，而且十分昂貴，因此采用可回收利用的方法如固定化法為好。

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