親和層析（AC）實(shí)驗步驟及注意事項

原理

通過(guò)生物分子之間的特異性相互作用來(lái)分離物質(zhì)的一種層析方法。包括基于空間結構特異結合的抗原/抗體，酶/底物、底物類(lèi)似物、抑制劑、激活劑、輔因子，激素/受體，核酸/核酸結合蛋白、互補核酸序列，和基于電子的供體和受體相互作用的金屬螯合、嗜硫親和等。該分離純化蛋白的方法高效、簡(jiǎn)單、快速、選擇性高。

用途

分離、純化蛋白

材料與儀器

樣品；親和層析柱；結合緩沖液；洗脫緩沖液。

步驟

①準備層析柱，根據目標蛋白量和填料載量確定柱體積；

② 準備樣品，通過(guò)過(guò)濾或離心除去顆粒性物質(zhì)，確保樣品中不含干擾結合的物質(zhì)，根據不同的親和層析類(lèi)型調整上樣緩沖液 pH；

③ 上樣前用上樣緩沖液平衡柱子或珠子，柱子需根據結合能力強弱確定上樣流速；

④ 孵育，對于親和磁珠需將樣品、抗體、珠子 4℃ 孵育一段時(shí)間后再進(jìn)行洗脫；

⑤洗脫，對于組蛋白標簽蛋白采用咪唑或低 pH 鹽溶液洗脫、對于 GST 融合蛋白采用含 10-20 mM 還原性谷胱甘肽的溶液洗脫、對于金黃色葡萄球菌蛋白 A 采用低 pH 鹽溶液洗脫；

⑥ 對于親和層析柱可以用結合緩沖液重新平衡柱子或用儲存液沖洗柱子，再生利用。

注意事項

1、帶不同標簽的待純化蛋白要根據標簽的差異選擇不同的洗脫方法，常用的洗脫緩沖液有高鹽洗脫液、低 pH 洗脫液、還原谷胱甘肽洗脫緩沖液、EDTA 洗脫液等；

2、Ni 親和層析柱可分為 Ni-IDA (螯合三價(jià))和 Ni-NTA (螯合四價(jià))，IDA 載量要比 NTA 高，IDA 與蛋白結合能力弱、穩定性差、Ni易脫落，純化回收 His 標簽蛋白選擇螯合鎳更穩定、更耐受還原劑、特異性更高的 NTA 層析柱更好；

3、GST 親和層析的條件更溫和、更能保證蛋白活性；

4、純化回收過(guò)程中要添加穩定蛋白的蛋白酶抑制劑、根據親和原理合理添加金屬螯合劑、離子穩定劑和還原劑。

常見(jiàn)問(wèn)題

1、Ni 柱進(jìn)行蛋白純化需要注意什么?

緩沖液中不能有高濃度的電子供體基團、不能有強螯合劑、不能有高濃度強還原劑、不能含離子型去垢劑、避免含碳酸氫鈉等物質(zhì)；

2、GST 蛋白純化需要注意什么？

避免蛋白樣品超聲太劇烈或時(shí)間過(guò)長(cháng)引起的蛋白變性，增加洗脫緩沖液的 pH 值可在不增加還原谷胱甘肽濃度的情況下提高洗脫效率；

3、Protein A 純化蛋白需要注意什么？

要保證 Protein G 和抗體有充分的結合時(shí)間，抗體純度不夠會(huì )導致雜蛋白含量高、易引起蛋白沉淀。

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