疏水層析實(shí)驗（HIC）原理、實(shí)驗步驟及注意事項

原理

蛋白質(zhì)表面一般有疏水與親水基團，疏水層析是利用蛋白質(zhì)表面某一部分具有疏水性，與帶有疏水性的載體在高鹽濃度時(shí)結合。在洗脫時(shí)，將鹽濃度逐漸降低，因其疏水性不同而逐個(gè)地先后被洗脫而純化，可用于分離其它方法不易純化的蛋白質(zhì)。

疏水性蛋白質(zhì)溶解于水溶液中時(shí)會(huì )發(fā)生自我聚集或自身相互作用。這種自我聚集是形成多種生物學(xué)相互作用的基礎，如蛋白質(zhì)的折疊、蛋白質(zhì)-底物間的相互作用及蛋白質(zhì)，通過(guò)細胞膜的跨膜運輸。疏水作用層析可用于分析和制備規模的蛋白質(zhì)純化。

HIC 主要利用大分子中存在的疏水性區域與層析吸附劑上的疏水性配體結合。這種相互作用發(fā)生于有利于疏水相互作用的環(huán)境，如高鹽濃度溶液。對于非極性分子，水(極性溶液)本身不是一種好的溶劑。

在這種環(huán)境下，蛋白質(zhì)會(huì )發(fā)生自我聚集或者形成聚集體，使其自身處于zui低的熱力學(xué)能狀態(tài)。在蛋白質(zhì)發(fā)生自我聚集以前,水分子會(huì )在其每個(gè)分子周?chē)纬筛叨扔行蚪Y構。

在極性溶液中，非極性分子(如蛋白質(zhì))的自我聚集受到環(huán)境中凈熵值增加的驅動(dòng)。在蛋白質(zhì)聚售過(guò)程中，暴露于極性溶劑的蛋白質(zhì)疏水位點(diǎn)整體表面區域減少，從而形成縮小結構(高熵的)環(huán)境，這是一種更有利的熱力學(xué)狀態(tài)。

用途

疏水層析不具備高分辨率，但其特性與離子交換層析互補，可用于純化難以分離的蛋白質(zhì)。

實(shí)例1:

雞蛋溶菌酶和鯨肌球蛋白的同步分離純化
采用 Pheny1 SepharoseHP 色譜柱，實(shí)現對雞蛋溶菌酶和鯨肌球蛋白混合。

200 操作過(guò)程:

①用 5 倍柱體積的緩沖液 A(50mmol/L磷酸鈉， pH 為 7.0;2molL)衡柱子，保證穩定。

②進(jìn)樣 1.5mL 品，用4倍柱體積緩沖液 A 沖洗柱子，用 0~100% 的緩沖液 B 進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積大于 30 倍柱體積，收集取樣1mL。

③用 4 倍柱體積的緩沖液 B(pH7.0，50mmoVL 緩沖)進(jìn)行洗脫。流速控制: 2mL/min，測定在 280nm 吸光度值。

材料與儀器

試劑：
10% 硫酸銨溶液、平衡緩沖液為 10 mmol/LNa2HPO4，/NaH2PO4，1.0 mol/L（NH2SO4（pH7.4）；洗脫緩沖液為 10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4（pH7.4）、SDS-PAGE

材料：層析柱、色譜填料

儀器： pH計、勻質(zhì)機、離心機、蛋白純化儀

步驟

1．硫酸銨鹽析取組織勻漿 30 g 溶于 60 ml 硫酸銨溶液（10%）中，攪拌溶解 4 小時(shí)，12000 g 離心 20 分鐘；取上清液，緩緩加入硫酸銨粉末并不斷攪動(dòng)，使溶液達到 35% 的飽和度，常溫靜置 2 小時(shí)；12000 g 離心 20 分鐘；

取上清液，繼續緩緩加入硫酸銨粉末并不斷攪動(dòng)，使溶液達到 70% 的飽和度，常溫靜置 2 小時(shí)。12000 g 離心 20 分鐘，棄上清液，將沉淀溶解后進(jìn)行疏水層析。

2．疏水層析應先用小號柱子進(jìn)行層析條件的摸索，包括層析介質(zhì)、結合和洗脫條件等。先選用 2.6 cm x 10 cm 層析柱，平衡緩沖液為 10 mmol/L Na2HPO4，/NaH2PO4，1.0 mol/L（NH2SO4（pH7.4）；洗脫緩沖液為 10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4（pH 7.4）。

選用 Phenyl Sepharose FF、Octyl Sepharose FF 和 Butyl Sepharose FF 三種疏水介質(zhì)進(jìn)行比較，梯度洗脫，流速為 0.2 ml/min。預實(shí)驗完成，選擇純化效果相對更好的 Butyl Sepharose FF 介質(zhì)、7.6 cm x 10 cm 層析柱，進(jìn)行大量層析純化。

3．純度鑒定用 SDS-PAGE 鑒定純化蛋白的純度。同時(shí)應定量測定純化產(chǎn)物的胰激肽釋放酶活性。

4．實(shí)驗結果分析 35% 飽和度的硫酸銨溶液沉淀可以除去粗品中的部分雜蛋白；再通過(guò) 70% 飽和度的硫酸銨溶液沉淀后，不但可以將胰激肽釋放酶蛋白全部沉淀，同時(shí)可起到濃縮樣品的作用。實(shí)驗采用高離子強度緩沖液平衡，胰激肽釋放酶吸附于疏水介質(zhì)上，然后在低離子強度條件下洗脫。

實(shí)驗中發(fā)現 Octyl Sepharose FF 吸附蛋白能力最弱，在洗脫初始階段，大部分蛋白即被洗脫下來(lái)；PhenylSepharose FF 吸附蛋白能力zui強，洗脫液離子強度很低的條件下大部分蛋白才被洗脫下來(lái)，這兩種介質(zhì)對分離胰激肽釋放酶蛋白的效果都不明顯。

Butyl Sepharose FF 介質(zhì)疏水性適中，可以保證溫和條件下洗脫胰激肽釋放酶。SDS-PAGE 分析結果表明鹽析后經(jīng)過(guò)一步疏水層析提純，得到比活性大于 500U/mg 的胰激肽釋放酶蛋白，電泳膠銀染色顯示有分子量在 28 kDa 左右的條帶，符合預期。

注意事項

1、在樣品上樣于層析柱之前，必須采用高濃度鹽的緩沖液提高蛋白質(zhì)混合物(將要采用 HIC 吸附劑純化的樣品)的鹽濃度，目的在于使目標蛋白質(zhì)能夠與吸附劑結合。

2、蛋白質(zhì)在高鹽濃度下可能發(fā)生沉淀，所以，在選擇鹽溶液之前，應先評估蛋白質(zhì)復合物在給定鹽溶液中的溶解性。

3、緩沖液的 pH 對于蛋白質(zhì)結合于 HIC 吸附劑的影響并不呈一般性的趨勢，但是可以影響相互作用的強度。選擇緩沖液的 pH，應該確保蛋白質(zhì)和吸附劑在該環(huán)境下能夠穩定(如避免使用過(guò)高/過(guò)低的pH 溶液)。

4、在調整蛋白質(zhì)上樣的步驟中，鹽的濃度可以為 05~20mol/L，并且可提高濃度以確保蛋白質(zhì)能夠有效結合于吸附劑。

5、蛋白質(zhì)結合于吸附劑所需要的鹽濃度在很大程度上取決于鹽種類(lèi)的選擇。如部分所述鹽種類(lèi)。在大多數情況下，選擇蛋白質(zhì)結合于吸附劑的適合鹽濃度需進(jìn)行相關(guān)的預實(shí)驗。蛋白質(zhì)結合于吸附劑上之后，必須再將目標蛋白質(zhì)洗脫，并收集層析柱柱后的流出液。多數情況下，洗脫過(guò)程用于將不需要的蛋白質(zhì)從目標蛋白質(zhì)中分離或者去除。不需要的蛋白質(zhì)可能與吸附劑結合的不是那么緊密,因而會(huì )先干目標蛋白質(zhì)被洗脫。

另外一些情況下，不需要的蛋白質(zhì)會(huì )與吸附劑結合更加緊密，并會(huì )在目標蛋白質(zhì)被洗脫之后仍與吸附劑結合。這種情況通常發(fā)生在 HIC 分離蛋白質(zhì)多聚體時(shí)，目標蛋白質(zhì)多聚體與吸附劑的結合比單體與吸附劑的結合更加緊密。在洗脫步驟中，流出液組分可能含有高純度產(chǎn)品,但在其之前或之后也會(huì )含有大量的不需要的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。

常見(jiàn)問(wèn)題

1、蛋白質(zhì)在高鹽濃度下可能發(fā)生沉淀，所以，在選擇鹽溶液之前，應先評估蛋白質(zhì)復合物在給定鹽溶液中的溶解性。

2、緩沖液的 pH 對于蛋白質(zhì)結合于 HIC 吸附劑的影響并不呈一般性的趨勢，但是可以影響相互作用的強度。選擇緩沖液的 pH，應該確保蛋白質(zhì)和吸附劑在該環(huán)境下能夠穩定(如避免使用pH過(guò)高/過(guò)低的溶液)。

3、可加少量還原劑或者去污劑防止蛋白聚集。

4、蛋白低鹽洗脫后盡快換至穩定緩沖液中。

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