GST 共結合純化法原理、試劑及實(shí)驗步驟

原理

瓊脂糖顆粒和誘餌蛋白復合體在洗滌時(shí)并不會(huì )損失而且所有反應都含有等量的誘餌蛋白。為了證明在洗滌期間沒(méi)有任何材料損失，應使用 1/10 的 GST 融合體加樣做平行 SDS-PAGE 凝膠電泳并染色以便更確切地比較 GST 融合體蛋白帶。另外，融合蛋白的降解可能導致誘餌蛋白的量減少，尤其是當使用粗提物（見(jiàn)圖 19.2.1）而不是純化標記的實(shí)驗蛋白時(shí)。在對結合實(shí)驗蛋白進(jìn)行定量時(shí)必須將降解量計算在內。

材料與儀器

E.coli 提取物（溶于瓊脂糖顆粒結合緩沖液） [35S] Met 標記蛋白質(zhì) GST 融合蛋白（GST 和與瓊脂糖顆粒結合）
1 × SDS 樣品緩沖液 凝膠固定液（10% 冰醋酸／45% 甲醇）
離心機和 Beckman TLA-100轉子 微量離心機 4℃ X射線(xiàn)膠片／儲存磷光子屏 掃描光密度儀／磷光子顯像儀

步驟

1. E.coli 可溶性蛋白抽提物放置在冰上解凍。

2. 每個(gè)反應取 500μl 解凍的 E.coli 提取物于 4℃，175000 g (使用 Beckman TLA-100 轉子為 70000r/min）離心 30 min。

3. 轉移上清液（不小于 400 μl）到 2 個(gè)試管中，每管 200 μl，并冰浴保存。

4. 在一支含 200 μl 步驟 3 獲得的上清液試管中加入 1~5 μl [35S] 甲硫氨酸標記的實(shí)驗蛋白，并冰浴 15 min。

5. 4℃ 以最大速度微量離心 15 min，從體外轉錄混合物中除去不溶性蛋白質(zhì)聚合體。將 200μl 上清液（含標記實(shí)驗蛋白和提取物）轉移到一個(gè)潔凈的試管中。

6. 在另外一支含 200 μl 步驟 3 獲得的上清液加入 20 μl 與瓊脂糖顆粒結合的 GST 或 GST 融合蛋白（誘餌蛋白）并充分混勻。

每個(gè)反應需要 2~5 μg GST 誘餌蛋白融合體。在每個(gè)反應中最好加入約 20 μl 瓊脂糖顆粒以便在 洗滌時(shí)可見(jiàn)到瓊脂糖顆粒的沉淀。然而，如果 20 μl 瓊脂糖顆粒結合的蛋白質(zhì)超過(guò) 2~5 μg，即可補加未結合谷胱甘肽的瓊脂糖顆粒提供必要的體積。

7. 將 200 μl 混勻的瓊脂糖顆粒提取物懸液（步驟 6）加到含實(shí)驗蛋白提取物（步驟 5）中。緩慢搖動(dòng)于 4℃ 孵育 1~2 h。

8. 4℃ 以最大速度微量離心反應物 1 min，沉淀瓊脂糖顆粒。移去上清液，瓊脂糖顆粒沉淀用 1 ml 瓊脂糖顆粒結合緩沖液洗滌，共洗 3 次。每次洗滌之后于 4℃ 以最大速度微量離心 1 min。最后一次洗漆后應小心移去所有液體。

除去所有液體以確保在分析性 SDS-PAGE 凝膠上所加的樣品量相等?？捎脭Q成條的薄型濾紙或帶很薄尖頭的 SDS 加樣吸頭除去最后遺留的幾微升液體。

9. 在每支試管中直接加入 25 μl 1×SDS 樣品緩沖液并置沸水浴 5 min。做分析性 SDS-PAGE 凝膠電泳。

所需樣品量依據不同的誘餌蛋白/靶蛋白對和檢測方式而不同。加入全部樣品可避免加樣體積的問(wèn)題，因為這樣就不存在所加樣品與未加樣品間比率不確定的因素了。

10. 可選：用考馬斯亮藍染色。

11. 在凝膠固定液中于室溫將凝膠固定 30 min，緩慢振蕩。干膠并做放射自顯影或將它置于一個(gè)儲存磷光子的屏幕上。使用掃描光密度計或磷光子顯像儀對 X 射線(xiàn)片進(jìn)行定性分析。

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