串聯(lián)親和純化技術(shù)法所用試劑、操作步驟及注意事項

簡(jiǎn)介

串聯(lián)親和純化技術(shù)法是由 Rigaut 等于 1999 年建立的能快速研究體內蛋白質(zhì)相互作用的新技術(shù)，用于在接近細胞真實(shí)生理狀態(tài)的條件下純化細胞體內的蛋白質(zhì)復合體。

材料與儀器

器材：SDS- PAGE 電泳裝置、離心機、EP 管、水浴鍋。

試劑：

① IgG Sepharose 6 Fast Flow matrix

② AcTEV protease

③ Calmodulin Affinity Resin

④ NP-40 緩沖液

⑤ IPP150 緩沖液

⑥ TEVCB 緩沖液

⑦ CBB buffer（0.1％ 和 0.02％）

⑧ CEB buffer

步驟

串聯(lián)親和純化技術(shù)法的基本過(guò)程可分為如下幾步：

（一）細胞裂解及蛋白樣品的制備

A. 懸浮細胞：1400 r/min，4℃ 離心 5 分鐘，用預冷的 PBS 洗 3 次，按 1ml/107 個(gè)細胞加入 NP-40 裂解液，冰箱內垂直搖床裂解 60 分鐘，12000 r/min，4℃ 離心 20 分鐘，回收上清，即為細胞的蛋白裂解液。

B. 貼壁細胞：用預冷的 PBS 洗 3 次，加入 NP-40 裂解液 1ml（90 mm 培養皿），冰上放置 10-60 分鐘，吹打細胞并移入 15 ml 離心管中，12 000r/min4℃ 離心 20 分鐘回收上清，即為細胞的蛋白溶解液。細胞裂解液短期可 4℃ 保存或-80℃ 長(cháng)期保存。

（二）IgG 親和層析

A. 取 500μl IgG-瓊脂糖微珠和 NP-40 裂解液 1：1（V/V）混合，加入上一步得到的上清中，4℃ 搖床孵育 3 小時(shí)。

B. 4℃，1200r/min 離心 2 分鐘，緩慢除去上清，注意不要觸及底部沉淀。

C. 用預冷的 IPP150 緩沖液洗沉淀 3 次，每次 10 ml。

（三）TEV 酶切

A. 將上一步得到的沉淀轉移至 1.5 ml 離心管中，用預冷 TEVCB 緩沖液洗滌三遍，每次 1 ml。

B. 加入含有 20 個(gè)單位 AcTEV 蛋白酶的 TEVCB 緩沖液 1 ml，室溫反應 2 小時(shí)或 4℃ 搖床過(guò)夜。

C. 12000r/min 離心 1 分鐘，收集上清（約 1 ml），轉移至 15 ml 離心管中。

（四）鈣調蛋白親和純化

A. 將 6ml 0.1％CBB 緩沖液加入上一步得到的 IgG 純化洗脫液中。

B. 取 250μl 的鈣調蛋白親和微珠，用 1ml 0.1％CBB 緩沖液洗滌 3 遍。

C. 微珠與 0.1％CBB 緩沖液 1：1（V/V）混合，加入到 IgG 純化洗脫液中，4℃ 搖床孵育 3 小時(shí)。

D. 1200r/min 離心 2 分鐘，10ml 0.02％CBB 緩沖液洗沉淀 3 次。

（五）EGTA 洗脫

A. 將上一步得到的鈣調蛋白微珠沉淀轉移至 1.5ml 離心管，加入 100-200μl 的 CEB 緩沖液，4℃ 搖床孵育 2 小時(shí)。

B. 1200r/min 離心 2 分，收集上清，用于 SDS-PAGE 或免疫印跡分析。

（六）蛋白質(zhì)電泳分離（SDS-PAGE）

A. 安裝電泳裝置和玻璃板。

B. 配制分離膠：按照所需濃度和體積依次混合 H20,30％ 丙烯酰胺，1.5mol/L Tris（pH8.8），10％SDS，10％ 過(guò)硫酸銨，最后加入 TEMED，立即快速混勻。

C. 迅速在兩玻璃板間隙灌入分離膠溶液，留出沉積膠所需體積和梳子齒長(cháng)高度。小心地在膠上覆蓋一層去離子 H20，垂直放置于室溫中，約 30 分鐘使膠凝聚。

D. 倒出分離膠上方覆蓋液體，盡量吸干。

E. 配制 5％ 濃縮膠，依次混合 H20,30％ 丙烯酰胺，1.5mol/L Tris（pH8.8），10％SDS，10％ 過(guò)硫酸銨，最后加入 TEMED，立即快速混勻。

F. 在分離膠上方灌入濃縮膠，并插入梳子，避免氣泡！再灌入適量濃縮膠填滿(mǎn)梳子齒間縫隙，垂直放置于室溫。

G. 將蛋白樣品加入等量 2 x SDS 加樣緩沖液，100℃ 加熱 3 分鐘使蛋白變性。2000r/min，常溫離心 3 分鐘。

H. 取出濃縮膠中梳子，以 H2O 去除未聚合丙烯酰胺。將凝膠裝置固定于電泳裝置中，在上、下槽均加滿(mǎn) Tris-Glysine 電泳緩沖液。

L. 加樣 10-20μl。

I. 將電泳裝置通電，電壓 8V/cm，當染料前沿進(jìn)入分離膠后，電壓提高到 15V/cm，電泳至溴酚藍到達膠底部，約 2-4 小時(shí)。

J. 關(guān)閉電源，取出玻璃板，撬開(kāi)玻璃板，小心取出凝膠。

7. 考馬斯亮藍染色或銀染。

8. 質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)復合物的組成。

注意事項

1．實(shí)驗設計 在開(kāi)始 TAP 實(shí)驗前，需要考慮以下幾點(diǎn)：

① 確認靶蛋白中不存在 TEV 酶的識別位點(diǎn)：EXXYXQ（G／S）；

② 根據不同蛋白質(zhì)的結構，確定 TAP 標簽位于靶蛋白的 N 端還是 C 端，以不影響靶蛋白的正常折疊和功能為準則；

③ 靶蛋白的表達量：通常不推薦使用過(guò)表達來(lái)進(jìn)行 TAP 純化，這會(huì )影響細胞的生理環(huán)境，提高實(shí)驗假陽(yáng)性，因此使用內源性啟動(dòng)子較為合適；

④ 選擇適合的 TAP 標簽：最初的 TAP 標簽由 Protein A 和鈣調蛋白組成，但此標簽分子量較大，可能會(huì )影響靶蛋白的折疊；現已有由 Protein A 和 Flag 等組成的 TAP 標簽，在保持高親和力的同時(shí)減少對靶蛋白的干擾，可以從優(yōu)選擇；

⑤ 對照：比較好的對照是含有 TAP 標簽但不含有靶蛋白的細胞株，提高實(shí)驗特異性。

2．由于整個(gè)實(shí)驗過(guò)程較長(cháng)、步驟較多，建議在每步洗脫時(shí)留取少量洗脫液，在實(shí)驗結果不理想時(shí)可以幫助發(fā)現和解決潛在的問(wèn)題。

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